魏于凡、陳春廷、陳裕文 / 國立宜蘭大學生物技術與動物科學系
一、前言
蜂蜜是蜜蜂採集花蜜 (Nectar)、植物外泌液 (Excretion) 或昆蟲蜜露 (Honeydew) 經蜜蜂儲存釀造於蜂巢之天然甜味物質 (安奎等, 2004)。蜂巢中由外勤蜂自蜜源植物的蜜腺吸取花蜜混合下咽喉腺所分泌的酵素存於腹部的蜜胃飛回巢中，每隻外勤蜂一次只能帶回20 mg左右的花蜜，採集1公斤的花蜜外勤蜂需飛行5~6萬次，而生產1公克蜂蜜，外勤蜂需要採集約1500~1600朵花的花蜜。
臺灣地區每年2~5月因南北地域氣溫的差異，荔枝與龍眼蜜源具由南往北開花之趨勢，蜂農逐花而居，為當年度蜂蜜之主要產期。依蜜源種類區分主要蜜源以龍眼蜂蜜為主，其產量深受當年龍眼開花、流蜜與天候變化影響；其它重要的蜜粉源植物有茶花 (10月~翌年2月，粉源為主)、柑橘類 (2~3月)、油菜 (12月~翌年2月)、羅式鹽膚木 (10月，粉源) 及咸豐草 (全年) 等蜜粉源 (盧美君, 2016)。
在蜂蜜摻假當中常出現的摻假情形大致可分為以下幾種：(一)、人造蜂蜜：蜂蜜含量非常低，透過添加一些人工香精、調色劑，混合糖漿製成。(二)、工廠混摻：與人造蜂蜜相比蜂蜜含量較高，透過與糖漿大量混合，增加產量，以提高利潤。(三)、糖蜜殘留：較易發生在頭期蜜，通常是蜂農餵飼糖水所殘留，在進入採蜜期時尚未消耗完畢而與採收的蜜混合所殘留。(四)、產地摻假：在台灣有不少進口商會進口泰國龍眼蜜，由於泰國龍眼蜜價格通常比較低，於是會有用泰國龍眼蜜假冒台灣龍眼蜜的情形，賺取當中的價差。(五)、蜜源摻假：龍眼蜜的價格通常高於其他種類蜂蜜；也有標榜龍眼蜜，但是其實並非純的龍眼蜜，混摻其他蜜源的蜂蜜或是根本不是龍眼蜜，而以龍眼蜜的價格來販賣。
天然食品的鑑別是一個非常複雜的問題，很難由單獨一種科學分析技術來解決，在傳統的化學分析中，樣品的前處理方法是需要耗費時間和耗材成本，同時有機溶劑的使用對環境也有不良影響。本論文使用的氣相層析離子泳動光譜分析儀結合頂空採樣的系統，只需將待測樣品秤量所需重量至上機使用的分析樣品瓶中，設定好分析的條件即可，樣品不需要任何前處理。透過頂空採樣系統的加熱器進行震盪搖晃及加熱，將樣品中所含的可揮發性化合物激發出來，再由自動進樣系統抽取樣品瓶中上端的氣體，注射進樣到分析系統當中，具有簡便、快速且耗材低廉的優點。
蜂蜜產地的鑑別，由於穩定同位素比例分析的技術發展，Kropf et al. (2010a) 透過利用δ13Choney、δ13Cprotein、δ15N等三項穩定同位素因子，探討鑑別蜂蜜產區與蜜源的可行性；一共分析271件司洛維尼亞的蜂蜜樣品 (2004~2006)，產自四個不同的司洛維尼亞地理區，七種不同植物蜜源。分析結果顯示穩定同位素技術並無法有效區分蜂蜜的蜜源植物，但在四個不同地理產區的蜂蜜樣品卻有不同的同位素特性，使用線性判別分析 (Linear discriminant analysis) 若不考慮蜜源種類，地理產區正確鑑別率達55%以上；在已知蜜源的狀況下，洋槐 ( black locust) 及萊姆 (lime) 蜂蜜的地理產區正確鑑別率則高達84.6%與88.9%。Kropf et al. (2010b) 又利用這項穩定同位素技術探討司洛維尼亞產的洋槐 ( black locust)、椴樹 (lime)、板栗 (chestnut) 的蜂蜜樣品共122件 (2004~2006)，產地鑑別正確率分別高達98.2%、100%、94.6%。
由於蜂蜜的風味是消費者對蜂蜜喜好最直觀且重要的關鍵因子，在蜂蜜中的揮發性有機化合物 (Volatile organic compounds) 已有研究顯示可作為區分不同產地蜂蜜的關鍵標記。Stanimirova et al. (2010) 利用頂空採樣 (Head-space) 固相微萃取技術 (Solid phase microextraction) 結合二維氣相層析-飛行時間質譜儀 (two-dimensional gas chromatography–time-of-flight mass spectrometry) 用於分析科西嘉島與非科西嘉島不同產地間蜂蜜樣品 (2006~2007) 的26種揮發性有機化合物，再透過不同的統計方法分析，結果顯示可區分科西嘉島上與非科西嘉島不同產地之蜂蜜。
除了以上的研究方法可用於鑑別蜂蜜產地之外，另外也還有許多不同分析儀器用於蜂蜜產地的區分，例如：Batista et al. (2013) 利用感應耦合電漿質譜儀 (Inductively coupled plasma mass spectrometry) 分析了57件來自巴西24個不同城市的蜂蜜樣品並進行區分。Consonni & cagliani (2008) 和Consonni et al. (2013) 利用核磁共振光譜儀 (Nuclear magnetic resonance spectroscopy) 分別對不同國家的蜂蜜樣品進行分析區別。
二、材料與方法
一、樣本資訊
* 標示為選作標準參考品的樣品
TWLG編號為確定台灣龍眼蜜源的樣品；NLG編號為確定非龍眼蜜源的樣品
THLG編號為泰國龍眼蜜的樣品；MKT編號為市售樣品。
以上蜂蜜樣品皆為宜蘭大學蜜蜂與蜂產品研發中心收集分析用，保存方式為存放在-20℃的冷凍櫃中，需要時取用。
二、GC-IMS儀器相關資訊
1. 儀器規格與耗材
儀器名稱：Gas Chromatograph Ion Mobility Spectrometer (GC-IMS)
儀器型號：Flavour Spec®
製造廠商：G.A.S. Dortmund, Germany
常用耗材為99.9995%氮氣、20 mL分析用玻璃樣品瓶。
2. 儀器分析方法條件
頂空採樣加熱器：15min；60℃
頂空採樣取樣體積：600µL
注射器溫度設定：80℃
進樣孔端溫度設定：80℃
氣相層析分離管柱溫度設定：40℃
離子泳動飄移管溫度設定：45℃
載氣氣體：99.9995%氮氣， 2~25 mL/min；0~10min梯度流量
25~75 mL/min；10~20min梯度流量
150 mL/min；20~25min固定流量(沖洗)
飄移氣體：99.9995%氮氣，150 mL/min；0~20min 固定流量
50 mL/min；20~25min 固定流量(沖洗)
訊號紀錄時間：0~20min
蜂蜜樣品皆取1g至樣品瓶中進行分析。每個樣品皆進行三重複分析。
3. 數據分析軟體：原始數據分析皆使用原廠提供的分析軟體。
主程式LAV software version 2.0.0 (G.A.S. Dortmund, Germany) ：
色譜圖輸出Topographic view output
訊號的指紋圖譜輸出Fingerprint plot output
主成分分析Principal components analysis (PCA)
三、蜜源種類的鑑別
使用樣品為台灣龍眼蜜 (TWLG-22、24、25) 三件，台灣荔枝蜜 (NLG-03、MKT-12、13) 三件，台灣柳丁蜜 (MKT-10、11) 兩件，台灣百花蜜 (NLG-01、MKT-09) 兩件，台灣咸豐草蜜 (MKT-08) 一件，台灣東方蜂紅淡蜜 (NLG-02) 一件，澳洲麥盧卡蜂蜜 (MKT-16) 一件，共13件樣品進行蜜源種類的鑑別分析。
四、龍眼蜜的產地鑑別
使用樣品為台灣龍眼蜜 (TWLG-01~15、22、24) 十七件，泰國龍眼蜜 (THLG-01~12、MKT-06) 十三件，共30件樣品進行龍眼蜜的產地鑑別分析
三、結果
一、蜜源種類的鑑別結果
不同蜜源種類蜂蜜樣品經GC-IMS分析所得色譜圖 (Topographic View)（圖一），當中A~G圖分別為咸豐草蜜 (MKT-08)、荔枝蜜 (NLG-03)、龍眼蜜 (TWLG-25)、麥盧卡蜜 (MKT-16)、百花蜜 (NLG-01)、紅淡蜜 (NLG-02)、柳丁蜜 (MKT-11)。根據13件蜜源蜂蜜樣品分析所得色譜圖，選取各樣品訊號利用分析軟體產生訊號的指紋圖譜（圖二），透過指紋圖譜能夠更清楚看到選取的訊號在各蜜源樣品間產生的差異。
圖一、蜜源種類鑑別相關樣品的色譜圖 (Topographic View) ： A~G圖分別為咸豐草蜜、荔枝蜜、龍眼蜜、麥盧卡蜜、百花蜜、紅淡蜜、柳丁蜜的色譜圖。
圖二、蜜源種類鑑別樣品的指紋圖譜：右方由上而下依顏色分為咸豐草蜜、荔枝蜜、龍眼蜜、麥盧卡蜜、百花蜜、紅淡蜜、柳丁蜜。
再依據選取的訊號作主成分分析，結果如圖三，由圖上各種不同蜜源樣品分佈情形沒有重疊，代表能夠區分出各蜜源的不同。其中龍眼蜜 (TWLG-22、24、25)、荔枝蜜 (NLG-03、MKT-12、13) 為比較相近的蜜源 (無患子科)，所以位置上比較接近，柳丁蜜 (MKT-10、11) 也在分佈上與龍眼蜜較為相近；而百花蜜 (NLG-01、MKT-09) 和咸豐草蜜 (MKT-08) 則是差異性較大所以分佈不一，澳洲的麥盧卡蜜 (MKT-16) 與紅淡蜜 (NLG-02) 則是明顯與其他蜜不同。
圖三、蜜源種類鑑別的主成分分析結果。
由以上結果可以瞭解在不同的蜜源蜂蜜樣品，透過GC-IMS分析之後所得到的訊號有所不同，而利用這些訊號作主成分分析可以得到具區別性的分佈結果。
二、龍眼蜜的產地鑑別結果
將台灣與泰國產龍眼蜜相關樣品利用GC-IMS分析所得色譜圖 (Topographic View) 如圖四所示，A.為台灣龍眼蜜 (TWLG-15)，B.為泰國龍眼蜜 (THLG-12)，C. & D.為宜大驗證龍眼蜜 (TWLG-22、24)，E.為泰國當地市售龍眼蜜 (MKT-06)，即使都是龍眼蜜但是分成上下兩個部份來觀察，可以發現部份訊號有所不同。
圖四、龍眼蜜產地鑑別相關樣品的色譜圖 (Topographic View) ： A.為台灣龍眼蜜，B.為泰國龍眼蜜，C. & D.為宜大驗證龍眼蜜，E.為泰國當地市售龍眼蜜。
以台灣龍眼蜜 (TWLG-01~15) 和泰國龍眼蜜 (THLG-01~12) 作為標準參考品產生的訊號為主要選取的訊號，利用分析軟體產生訊號指紋圖譜（圖五），右方由上而下依顏色分為台灣龍眼蜜 (TWLG-01~15)、泰國龍眼蜜 (THLG-01~12)、宜大驗證龍眼蜜 (TWLG-22、24) 及泰國當地市售龍眼蜜樣品 (MKT-06)，下方為選取作分析的訊號編號。透過指紋圖譜更容易觀察訊號在不同群體間的差異，證明雖然都是龍眼蜜但是產地不同，訊號確實會有一些差異存在。
圖五、龍眼蜜產地鑑別相關樣品的指紋圖譜：右方由上而下依顏色分為台灣龍眼蜜、泰國龍眼蜜、宜大驗證龍眼蜜及泰國當地市售龍眼蜜樣品，下方為選取作分析的訊號編號。
最後將選取的訊號進行主成分分析，結果如圖六，由主成分分析所得的分佈圖可以清楚看到台灣龍眼蜜 (TWLG-01~15) 與泰國龍眼蜜 (THLG-01~12) 區分成兩個區域，且並無交集情形，代表能夠區分其產地的不同。兩個宜大驗證龍眼蜜 (TWLG-22、24) 則與台灣龍眼蜜 (TWLG-01~15) 處在相近一個區域中，代表屬於該群體品質相似的樣品，泰國當地市售龍眼蜜樣品 (MKT-06) 則不屬於任何一方，代表與參考品皆不相同。透過以上分析，與參考品比對能夠快速的初步對未知樣品作出區別，瞭解其產地身分的所屬。
圖六、龍眼蜜產地鑑別的主成分分析結果。
另外六件龍眼蜜源樣品取自2017年台南市舉辦的龍眼蜜評鑑獲得特級獎的蜂蜜樣品，經GC-IMS分析所得色譜圖如圖七所示，A.為台灣龍眼蜜 (TWLG-15)、B.為泰國龍眼蜜 (THLG-12)、C.為宜大驗證龍眼蜜 (TWLG-22)、D. & E.為台南評鑑特級獎龍眼蜜 (TWLG-16、21)，由於都是龍眼蜜樣品，從色譜圖觀察是非常相像的。
圖七、龍眼蜜源與非龍眼蜜源相關樣品的色譜圖 (Topographic View) 之二 ： A.為台灣龍眼蜜、B.為泰國龍眼蜜、C.為宜大驗證龍眼蜜、D. & E.為台南評鑑特級獎龍眼蜜。
使用取自標準參考樣品群的訊號為代表，產生的訊號指紋圖主成分分析結果如圖八，結果顯示龍眼蜜蜜源的台南評鑑特級獎龍眼蜜 (TWLG-16~21) 樣品六件皆無接觸到台灣龍眼蜜參考樣品群的範圍。此結果與同為龍眼蜜源樣品的宜大驗證龍眼蜜 (TWLG-23~25) 結果相同。
圖八、龍眼蜜源與非龍眼蜜源鑑別的主成分分析結果圖之二：原本預期龍眼蜜蜜源樣品台南評鑑特級獎龍眼蜜六件應該在台灣龍眼蜜參考樣品的範圍內，但是由PCA分析結果並非如此。
四、討論
一、 蜜源種類的鑑別
在前言所述台灣主要的單一蜜源蜂蜜為龍眼與荔枝蜜，其他種類的蜜源約占10%左右，由於台灣地處溫帶與亞熱帶，氣候適合各種作物栽種，於是也產生各式各樣的特色蜂蜜，雖然占整體蜂蜜的比例不高，但對於這些特色蜜該如何判別，也是一個待解決的問題。以蜂農在採蜜時，如果方圓3公里內該單一蜜源的作物量夠多、生長正常且開花情形良好，採蜜的蜜蜂數量適中，在採蜜期內無特別不良氣候影響，綜合以上條件方能得到純度、品質都好的單一蜜源蜂蜜。
因為影響因素眾多，對於單一種蜜源的純度是比較難以定義其標準的，但若是比較不同蜜源間的差異，利用本實驗方法則能夠依據不同蜜源所產生特殊的氣味，透過GC-IMS分析後以色譜圖呈現其揮發性有機化合物所產生訊號分佈的情形，再經由選取訊號進行主成分分析來加以區別，是能夠辨別不同蜜源蜂蜜間的差異。
二、 龍眼蜜的產地鑑別
龍眼蜜的產地鑑別主要針對泰國的龍眼蜜與台灣的龍眼蜜作區別，原因為台灣主要的蜂蜜進口國為泰國，從市面販賣的蜂蜜也能看到不少標示為泰國產地的蜂蜜，除了泰國之外還有越南為蜂蜜第二大進口國，但龍眼蜜為主的進口蜜還是泰國產居多，因此對泰國龍眼蜜與台灣龍眼蜜作產地的區別分析，結果也顯示泰國產的龍眼蜜與台灣產的龍眼蜜可以利用GC-IMS技術鑑別之。
五、參考文獻
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陳裕文
chenyw@niu.edu.tw
宜蘭縣宜蘭市神農路一段1號