丁婕、楊恩誠 / 國立臺灣大學昆蟲學系
摘要
現行的農藥的蜜蜂毒性測定已有一定的規範和標準來量測與評估，最為各國所遵循的便是經濟合作暨發展組織 (Organization for Economic Co-operation and Development，簡稱OECD) 所公告的測試方法。自從1994年歐洲爆發這一波國際性的蜜蜂蜂群大量死亡消失問題以來，對於新尼古丁類殺蟲劑的蜜蜂毒性研究便在世界各國積極展開。然而傳統的標準量測方法並無法對於蜜蜂慢性毒性做出客觀的評量，導致非致死劑量或濃度的新尼古丁類殺蟲劑對蜜蜂個體與蜂群所造成的傷害無法顯現出來。直到近年從行為、生理、基因等不同層次的研究才逐漸浮現出該類藥劑對蜜蜂的毒害，其中益達胺的研究資料最多且研究的面相也最豐富。本文將概述OECD的測試方法與新尼古丁類殺蟲劑的非致死劑量影響，以闡述目前所施行的毒性評估方式其不足之處。
農藥對蜜蜂毒性測試介紹
蜜蜂為自然界中最重要之授粉昆蟲，於農作物生產中扮演傳媒的關鍵角色，根據調查，供應全球90 % 糧食來源的100種農作物中，高達71種必須仰賴蜜蜂授粉才能達成果實生產與採收種子 (Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2008)；而如今蜜蜂卻暴露於大量農藥的威脅之下，現代農業廣泛地使用農藥，蜜蜂可能在外出採集時進入施用農藥的農田當中，除了立刻接觸到施藥的農作物與雜草外，同時也會攝入帶有農藥的花粉及花蜜並將其帶回巢中。在施用農藥的田間實驗中，已經證實了新尼古丁類藥物對於蜜蜂族群數目與組成造成影響 (Henry et al., 2015)。
國際上農藥毒性的判定主要依循OECD組織所制定的標準試驗流程進行測量。針對蜜蜂的部分可分為以下幾項：蜜蜂成蟲口服急性毒性試驗 (honey bee, acute oral toxicity test)、蜜蜂成蟲接觸急性毒性試驗 (honey bee, acute contact toxicity test)、蜜蜂成蟲慢性口服毒性試驗 (honey bee, chronic oral toxicity test)與蜜蜂幼蟲重複暴露毒理試驗 (honey bee larval toxicity test following repeated exposure)。
以下提供各試驗項目之簡易實驗操作流程：
一、蜜蜂成蟲口服急性毒性試驗：將成年工蜂關入試驗用盒子飢餓兩小時後，提供100至200 μl含有待測藥物之50 %蔗糖水溶液，待測藥物至少處理五個測試劑量，一組毒性參考藥物與一組未處理組。每組至少10隻成蜂，該試驗應重複測量三次以上。並於4、24與48小時評估死亡率及亞致死劑量 (LC50, median lethal concentration)。
二、蜜蜂成蟲接觸急性毒性試驗：以二氧化碳或氮氣麻醉成年工蜂後，於胸背板上滴加1μl待測藥物。待測藥物至少處理五個測試劑量，一組毒性參考藥物與一組未處理組。每組至少10隻蜜蜂，該試驗應重複測量至少三次。並於4、24與48小時評估死亡率及亞致死劑量。
三、蜜蜂成蟲慢性口服毒性試驗：將羽化後兩日齡內之工蜂關入試驗用盒子，並給予含有待測藥物之50 %蔗糖水溶液，進行共計10日之試驗期，每日記錄死亡率與行為異常，計算10天後之LC50、LDD50 (median lethal dietary dose)、NOEC (no observed effect concentration) 與NOEDD (no observed effect dietary dose)。待測藥物至少處理五個測試劑量，一組毒性參考藥物與一組未處理組。每組至少10隻蜜蜂，該試驗應重複測量至少三次。
四、蜜蜂幼蟲重複暴露毒理試驗：將一日齡之蜜蜂幼蟲移入48孔盤中，於第三天 (D3) 至第六天 (D6) 每日餵食含有待測藥物之幼蟲食物，以每日遞增濃度的方式餵食，並於D6達到累積劑量濃度。待測藥物至少處理五個測試劑量，一組毒性參考藥物與一組未處理組。每組至少12隻蜜蜂幼蟲，該試驗應重複測量至少三次。於試驗期間紀錄D4到D8的幼蟲死亡率並觀察藥物對幼蟲成長、行為、形態是否造成影響，並於D15及D22記錄化蛹率與羽化率。 最終計算NOEC、NOEDD、EC50與ED50進行整體風險評估。
而國內之農藥對蜜蜂毒性規範由行政院農委會動植物防疫檢疫局訂立，用以測定農藥對蜜蜂之安全容許劑量，若農藥有效成分對蜜蜂造成死亡以外之影響，例如生殖發育、生長調節或其他慢性危害者，須提供「蜜蜂幼蟲口服急性毒性試驗」報告。「蜜蜂毒性之成品田間試驗」報告是以蜜蜂成蟲之農藥成品接觸急性毒性、農藥成品口服急性毒性試驗報告及田間施藥劑量，計算出風險商數 ( Risk Quotient , RQ, RQ = 每公頃農藥有效成分最大施用量 (g a.i./ha) / 半數致死劑量LD50 (μg a.i./bee))，若風險商數 (RQ) ≧ 50須繳交田間試驗報告，或對於幼蟲生殖、發育行為等試驗結果。空中噴藥需提供殘留農藥對蜜蜂毒性試驗，試驗以成品為試驗物質。農藥理化性及毒理試驗準則可由全國法規資料庫網站查詢（http://law.moj.gov.tw/LawClass/LawContent.aspx?PCODE=M0140027）。
類尼古丁藥劑亞致死劑量對蜜蜂影響的研究
接受到高劑量殺蟲劑的蜜蜂可能於採蜜途中死亡，但帶有低劑量殺蟲劑的蜜蜂依然能夠回到巢內，使得此低劑量殺蟲劑得以在巢內殘留累積，甚至將含微量殺蟲劑的花粉與蜂蜜餵食幼蟲，因此環境中殘留的低劑量類尼古丁類殺蟲劑對蜜蜂的影響已逐漸被重視。殘留量分析指出花粉、蜂蜜或是蜂蠟殘當中，同時累積了多種殺蟲劑 (Mullin et al., 2010; Krupke and Long 2015; David et al., 2016)。但是於蜂巢中農藥的亞致死劑量研究卻鮮少有人研究。
已有研究證實，在農藥污染的巢片孕育的幼蟲會有延遲發育以及成蟲壽命縮短的情況 (Wu et al., 2011)。此外，蜜蜂黑王台病毒 (black queen cell virus, BQCV)和賽果培會有加成作用進而影響幼蟲存活率 (Doublet et al., 2014)。 最近的一項研究證實，美洲幼蟲病 (AFB) 的致病因子類芽孢桿菌的與亞致死劑量的大滅松或可尼丁時會產生協同作用 (López et al., 2017)。此實驗驗證了幼蟲從個體到群體對於綜合緊迫因子產生的的細胞反應，揭開了先前研究無法檢測到的殺蟲劑半致死劑量對蜜蜂族群之影響。2008年Yang et al. 首度發表研究報告指出，只餵食4 ng的益達胺即可影響外勤蜂的行為，而此劑量遠低於半致死劑量 (LD50 = 118.7 ng/bee)(Yang et al., 2008)。
Matsumoto (2013) 亦報導證實低劑量的可尼丁會影響外勤蜂回巢率；除此之外，蜜蜂在冬天時接受非常低劑量 (0.74 ng/bee/day) 的益達胺與可尼丁，連續13個禮拜後，蜂族群明顯減少了一半 (Lu et al. 2014)。這些結果都指出低劑量殺蟲劑影響蜜蜂的嚴重性。Yang et al. 於2012年發表研究報告指出蜜蜂於幼蟲時期接受極低量的益達胺 (0.01 ng/larva) 餵食處理下，蜜蜂仍然能羽化為成蟲，但其羽化後成蟲的嗅覺制約行為會受到影響 (Yang et al., 2012)。此外，實驗證據顯示，長期餵食含有低劑量的賽速安糖水的狀況下，蜜蜂的飛行時間與飛行距離顯著下降，這對蜜蜂的採集與歸巢效率造成影響 (Henry et al., 2012; Tosi et al., 2017)。
在Peng and Yang (2016) 研究中，利用免疫標記蜜蜂腦內蕈狀體環狀結構，進一步顯示了亞致死劑量的益達胺影響了蜂蜜腦神經發育。此結果不止證實嗅覺學習能力與異常神經連結相關，更證明益達胺會損傷幼蟲神經系統當中嗅覺與視覺神經相關區域的發育。為了揭開亞致死劑量益達胺對蜜蜂幼蟲造成的可能影響，Wu et al. (2017) 研究剛羽化的蜜蜂頭部全基因組表現狀況，證實暴露於亞致死劑量的益達胺會引起多種生理變化，包含影響了解毒、免疫、感覺、神經元發育、代謝、線粒體以及蜂王漿的合成。
討論與展望
從上述亞致死劑量對蜜蜂的影響研究中，不難發現即使在非致死劑量或濃度下，益達胺所造成的影響層面皆與原先新尼古丁類殺蟲劑的作用模式或作用機制相去甚遠。根據Insecticide Resistance Action Committee (簡稱IRAC) 對於殺蟲劑的作用模式分類，益達胺是屬於「菸鹼素性乙醯膽鹼受體競爭性調節劑」中4A類的新尼古丁殺蟲劑。這類殺蟲劑可與菸鹼素乙烯膽鹼受體結合，而使神經細胞膜上鈉離子通道持續打開，鈉離子持續進入神經細胞內而導致神經持續產生動作電位，最後蟲體因神經過度興奮而亡。現今的研究發現，亞致死劑量的益達胺作用在蜜蜂幼蟲並沒有讓幼蟲因神經過度興奮而死亡，反倒是影響了神經發育，甚至免疫系統及能量代謝系統等。這樣的結果極可能造成蜂群未來遭受病原菌攻擊時容易得病，或過冬時無法正常產生熱量來保持蜂群內的溫度。不幸的是，即使越來越多的科學證據支持著殺蟲劑慢性毒害可能對蜜蜂蜂群健康的影響，但是當檢視蜂群因病或失溫而衰竭崩潰之時，通常首先被排除的因子卻是殺蟲劑。
自從2006年蜜蜂基因體解序之後，比較蜜蜂與其他昆蟲之基因體發現，其相較於甘比亞瘧蚊 (Anopheles gambiae) 與果蠅 (Drosophila melanogaster) 之基因體演化速率慢，擁有較少數量的解毒基因與免疫基因 (Consortium, H.G.S., 2006; Evans et al., 2006)，顯示出蜜蜂並非像一般害蟲擁有極強的環境適應力，對於環境作物中日漸增加的農藥濃度，恐怕會危害其生存。以目前OECD的測試標準來看，雖然對於蜜蜂幼蟲慢性毒性有量測的標準，但是並無檢測蜜蜂幼蟲中毒之後發育成蟲的行為功能有檢測方法，這和目前越來越清楚的科學證據是有差距的，因此未來在判定農藥對蜜蜂健康的影響方面仍有很大的發展空間要努力。
過去五、六十年來，人類在地球上所施用的化學藥物的種類之多、數量之大，前所未有。這無疑是以化學藥物對自然界生物進行一場大規模的「人擇」的過程。目前已知在自然界中族群數量銳減的昆蟲並非只有蜜蜂，甚至有些種類的熊蜂在短短二十年內就已經滅絕 (Grixti et al., 2009)。農藥對於蜜蜂的慢性毒害所造成的影響無疑是一個警訊。最近的研究也顯示，過去未知的慢性毒害不只對蜜蜂族群有影響，對其他非昆蟲的動物亦然。例如，調查發現，在有益達胺污染的水源附近被發現鳥類、魚類、爬蟲類都有較易受病原菌攻擊的傾象，顯示這些動物的免疫力受到藥劑污染水源而下降 (Mason et al., 2013)。人類於自然環境中施用藥劑的行為實在需要更謹慎才是。
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楊恩誠
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